"Communication entre les cellules par les acides nucléiques circulants" par le. Dr. Mae-Wan Ho

Rapport ISIS 20/04/2009
La version originale en anglais, avec toutes les références, est intitulée Intercommunication via Circulating Nucleic Acids ; elle est accessible sur le site
www.i-sis.org.uk/circulatingNucleicAcids.php
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Les acides nucléiques (ADN et ARN) sont du matériel génétique généralement considéré comme confiné dans des cellules. Mais il a été découvert en 1948 que ces acides nucléiques pouvaient circuler dans le sang. Depuis lors, de nombreuses applications ont été développées pour diagnostiquer des cancers et d’autres maladies, sur la base de ces acides nucléiques circulants. [1]. La découverte de l’ADN fœtal circulant dans le sang de la mère a aussi ouvert la possibilité de diagnostic prénatal non invasif et de suivi de nombreux troubles et pathologies pendant la grossesse. Cependant, les origines et les fonctions de ces acides nucléiques restent, pour l’instant, obscures.

Mattias Courroies et Anders Wittrup de l’Université de Lund en Suède suggèrent que ces acides nucléiques circulants pourraient jouer un rôle important dans la communication intercellulaire et dans la signalisation biologique [2].

Tout au long de l’évolution des eucaryotes supérieurs (organismes à noyau dans leurs cellules), des mécanismes de transport sur les membranes cellulaires ont permis à des virus et autres microbes d’envahir la cellule, d’incorporer du matériel génétique étranger et de causer des maladies ; ces mécanismes ont été conservés et ils n’ont tout simplement pas de sens, à moins qu’ils ne servent à d’autres fonctions.

Des données récentes, provenant de différents domaines, mettent l’accent sur le trafic actif des acides nucléiques entre les cellules, qui pourraient faire appel à ces mécanismes. Le trafic des acides nucléiques peut être impliqué dans la signalisation intracellulaire au cours du développement, dans le remodelage épigénétique, la régénération des tissus et pour un réglage fin du système immunitaire adaptatif. Il peut également être impliqué dans le développement du cancer et dans la surveillance immunitaire.

Le trafic de l’ARN

Les ARNi systémiques

Il y a dix ans, il avait été constaté que de l’ARN double brin (ARNdb), injecté au laboratoire ou donné en nourriture aux vers nématodes Caenorhabdities elegans, déclenche une mise sous silence des transcriptions complémentaires des séquences de bases, chez les animaux adultes ainsi que chez leur descendance.

Plusieurs gènes sont impliqués dans cet ARN interférent systémique (ARNi). L’un d’eux, sid-1 (silencing systémique déficient-1) code pour une protéine qui se met en boucle et pénètre 11 fois à travers la membrane cellulaire pour former un pore dans la membrane pour le transport de l’ARNdb à travers celle-ci. Des homologues de Sid-1 ont été trouvés chez l’homme et chez d’autres mammifères, mais pas chez la mouche Drosophila melanogaster, qui semble utiliser d’autres mécanismes pour les ARNi systémiques.

La fourniture d’espèces d’ARNi dans le système circulatoire se traduit par des réponses systémiques de l’ARNi. Les réponses de l’ARNi sont amplifiées chez le ver nématode Caenorhabdities elegans et chez les plantes, par des polymérases à ARN qui sont dépendantes de ces ARN.
L’ARNi est omniprésent et essentiel pour le développement normal et pour la régulation génétique [3, 4] (voir Subverting the Genetic Text, SiS 24 ; Rewriting the Genetic Text in Human Brain Development, SiS 41) *.
* La version en français intitulée "Réécriture du texte génétique lors du développement du cerveau humain", par le Dr. Mae-Wan Ho, traduction et compléments de Jacques Hallard, est accessible sur le site http://yonne.lautre.net/spip.php?article4810&lang=fr

Le transport entre les cellules par des tunnels de nanotubes

Récemment, il a été découvert que des tunnels de nanotubes (TNT) peuvent établir une connexion entre des cellules adjacentes, permettant ainsi une continuité entre les cellules. [2]. Tout d’abord révélés dans des cellules en culture, les tunnels de nanotubes (TNT) ont été depuis détectés dans la cornée des mammifères.

Il existe deux types de tunnels de nanotubes (TNT) : un type de microtubules de petite taille < 0,7 m, contenant de l’actine, qui prend en charge le mouvement unidirectionnel des constituants de la membrane plasmique, y compris des agents pathogènes attachés à celle-ci, d’une part et, d’autre part, des microtubules plus grands, > 0,7 m, contenant des tubes qui prennent en charge le transport bidirectionnel des vésicules et des organites tels que les mitochondries et les endosomes (des inclusions liées à la membrane à l’intérieur des cellules). Les endosomes peuvent avoir une importance particulière pour la transmission des ARNi.

Rôle des plasmadesmes

Les plasmadesmes sont des canaux microscopiques qui traversent les parois des cellules, permettant un passage entre les cellules végétales ; ces plasmodesmes sont impliqués dans la communication directe de cellule à cellule chez les végétaux. Il a été démontré que le transport d’ARN surexprimé d’origine endogène se produit à travers les plasmadesmes.
Les virus de plantes codent pour des protéines mouvantes qui interviennent dans la propagation infectieuse des acides nucléiques viraux par les plasmadesmes. Des protéines végétales endogènes, y compris les facteurs de transcription, utilisent la même voie de circulation entre les cellules.

Il a aussi été démontré que la protéine codée par le ‘homeobox knotted1’ du maïs pourrait transférer sélectivement son propre ARNm vers des cellules environnantes par le biais des plasmodesmes.

Microvésicules et exosomes

Des signalisations à longue distance avec de l’ARN messager (ARNm) ou des micro-ARN (miRNA, impliqués dans l’ARN interférent ou ARNi), peuvent être réalisées par la présentation de ces espèces d’ARN dans des vésicules exocytotiques (sécrétion) dotées de motifs de ciblage spécifiques sur les surfaces cellulaires. Ces petites vésicules membranaires, ou exosomes (50-90 nm de diamètre), libérées par les cellules, peuvent très bien avoir un rôle dans la communication intercellulaire.

Les cellules souches embryonnaires sécrètent des vésicules des cellules qui sont hautement enrichies en ARN messagers (ARNm) spécifiques, et qui peuvent être transférées et induire des modifications phénotypiques dans des cellules progénitrices hématopoiétiques spécifiques (sang).
Les mastocytes, impliqués dans la réaction allergique du corps humain, sécrètent des exosomes qui contiennent un ensemble unique de 1.300 ARNm différents, dont certains sont traduits dans les cellules receveuses.
Les exosomes contiennent également plus de 100 micro-ARN (miARN) différents qui, du fait de leur promiscuité, interviennent dans la liaison et dans l’inactivation des ARN messagers (ARNm) cible : ainsi, l’impact sur l’expression des gènes dans les cellules receveuses pourrait être assez important.

Le trafic de l’ADN

Bien qu’il soit possible d’identifier les sources potentielles et les fonctions de certaines espèces d’ARN circulants des cellules vivantes, il n’est pas évident que l’ADN soit activement sécrété par les cellules vivantes.
Les exosomes ne contiennent pas d’ADN, mais le transfert horizontal de l’ADN se produit bien entre les cellules somatiques [2] ainsi qu’entre les cellules germinales [5] (Epigenetic Inheritance through Sperm Cells, the Lamarckian Dimension in Evolution, SiS 42) *.
* La version en français intitulée "Une hérédité épigénétique par l’intermédiaire des spermatozoïdes : l‘approche évolutive de Lamarck " par le Dr. Mae-Wan Ho, traduction et compléments de Jacques Hallard, est accessible sur le site http://yonne.lautre.net/spip.php?article4839&lang=fr

En fait, l’ADN, comme l’ARN, est si facilement absorbé qu’il a été largement exploité dans la ‘thérapie génique’, tandis que nos organismes de réglementation continuent d’ignorer les dangers potentiels – toujours croissants - de la panoplie des acides nucléiques qui sont libérés dans l’environnement par les cultures de plantes OGM (Organismes Génétiquement Modifiés) [6] (Slipping through the regulatory net, ISIS/TWN publication).

L’ADN est connu pour être relargué dans les corps apoptotiques [liés à l’apoptose], sortes de vésicules membranaires contenant de l’ADN fragmenté qui résultent de la mort cellulaire programmée. Et ces corps apoptotiques peuvent être phagocytés (engloutis, absorbés) et transportés dans le noyau des cellules du receveur, pour une intégration et une expression dans le génome.

La co-culture de lignées de cellules contenant des copies intégrées du virus d’Epstein-Barr [EBV] aboutit à l’adoption rapide et au transfert de l’ADN de l’EBV, ainsi que de l’ADN génomique, dans le noyau des cellules phagocytées [7]. Il s’agit d’un mode efficace de transfert de gènes, comme l’analyse par hybridation fluorescente in situ (FISH) des cellules endothéliales aortiques bovines, ont montré l’incorporation d’ADN apoptotique dans les noyaux de 15 pour cent des cellules phagocytées. Après un transfert de ce type, l’expression de gènes codés par l’EBV a été détectée aussi bien au niveau de l’ARNm que des protéines.

Des corps apoptotiques, dérivés de cellules tumorales, induisent des foyers (centres de malignité) dans des cultures in vitro de fibroblastes p53 déficients ; par ailleurs, ces corps apoptotiques induisent des tumeurs chez les animaux.

Des chromosomes entiers ou des fragments sont ainsi transférés par cette voie de la phagocytose et intégrés dans le génome [8]. Le transfert horizontal de gènes entre les cellules peut être important au cours de la progression tumorale.

Un autre mécanisme de transfert horizontal d’ADN a été suggéré par des études dans le cas de maladies auto-immunes [2].
Le peptide antimicrobien LL-37, qui est largement exprimé dans l’épithélium, la moelle osseuse et dans l’appareil génito-urinaire de l’homme, forme des complexes stables avec l’ADN extracellulaire et diffuse de l’ADN dans le noyau.

La fourniture de l’ADN interne, au moyen du peptide antimicrobien LL-37, peut être un événement précoce dans le cas d’une maladie auto-immune. La capacité de ce peptide LL-37 à transférer l’ADN à travers la membrane plasmique est une propriété partagée au sein de la famille grandissante des "peptides de pénétration cellulaire". Parmi eux, le peptide homéobox Antennapedia et la séquence de transduction Tat du virus VIH, sont dotés de cette capacité de médiation pour une absorption efficace des macromolécules dans une grande variété de cellules de mammifères.

Rôle des acides nucléiques circulants dans la santé et dans les pathologies

L’ADN circulant chez les patients cancéreux a de nombreuses caractéristiques en commun avec l’ADN de leurs tumeurs, et on soupçonne qu’ils sont issus de corps apoptotiques de cellules cancéreuses. En outre, la concentration élevée en soi est un révélateur des états pathologiques, que ce soit le cancer, le lupus érythémateux systémique, la polyarthrite rhumatoïde, la glomérulonéphrite du pancréas, l’hépatite, ainsi que les maladies inflammatoires de l’intestin, etc… [9].

Par exemple, les concentrations plasmatiques d’ADN chez 102 patients atteints de cancer du poumon et chez 105 sujets sains, ont été comparées en utilisant l’analyse par PCR quantitative [10]. Les concentrations plasmatiques de l’ADN, pour le groupe en bonne santé et pour le groupe de cancéreux, étaient de 10,4 et 22,6 ng / ml, respectivement (p < 0,0001). Des taux élevés d’ADN ont également été détectés chez des patients atteints de la maladie au stade I ou II.

Dans une autre étude, l’ADN du plasma a porté sur 121 femmes : 61 souffrant d’un cancer du sein, 33 patientes ayant l’une des maladies bénignes du sein et 27 patientes en bonne santé servant de témoins. Les données ont été comparées [11]. Le niveau médian était de 65 ng / ml chez les patientes atteintes du cancer du sein, sensiblement différente de celle des témoins avec une maladie bénigne 22 ng / ml et des patientes témoins en bonne santé 13 ng / ml.

Il y a actuellement un débat quant à savoir si l’ADN circulant est le seul dérivé de cellules mortes [12] ou si l’ADN est activement sécrété par les cellules vivantes [9, 13].

Maniesh van der Vaart et Piet Pretorius de la North-West University, à Potchefstroom, en Afrique du Sud, soulignent que l’ADN circulant chez des individus sains n’a tout simplement pas les caractéristiques de l’ADN des cellules résultant d’apoptose ou des autres cellules mortes 13]. Dans les cultures de cellules sans cellules mortes, l’ADN est néanmoins activement sécrété dans le milieu jusqu’à ce qu’une certaine concentration soit atteinte. Le remplacement du milieu conduit à de nouvelles sécrétions, jusqu’à ce que la concentration d’équilibre externe soit rétablie.

Van der Vaart et Pretorius soutiennent que dans un organisme sain, la plus grande partie, sinon la totalité de l’ADN des cellules mortes serait dégradée, supprimée immédiatement, phagocytée par les autres cellules situées à proximité, ou bien ventilée et dégradée dans les lysosomes intracellulaires.

Au lieu de cela, les cellules vivantes maintiennent un niveau d’équilibre faible de l’ADN circulant par la sécrétion. L’ADN sécrété est éliminé de la circulation, une part est sans doute absorbée par d’autres cellules et incorporée dans leur génome, bien que les auteurs eux-mêmes n’aient pas proposé cette possibilité (voir ci-dessous).

Toutefois, dans les états pathologiques, le taux de mort cellulaire est tel qu’il dépasse la capacité de la phagocytose des cellules normales à absorber et à détruire l’ADN, qui, par conséquent, peut s’échapper dans la circulation générale. Dans les états du cancer, il y a d’autres sources d’ADN qui sont excrétée par les cellules vivantes du cancer.

Par ailleurs, le groupe de recherche dirigé par Howard Urnovitz, PDG de la société Chronix Biomédical GmbH, à Goettingen, en Allemagne, utilisé la technologie du séquençage de l’ADN à haut débit en parallèle, pour obtenir des profils d’ADN circulants totaux dans le sérum de 51 hommes en bonne santé (27 femmes et 24 hommes) et il les a comparés avec les génomes de quatre des sujets analysés, ainsi qu’avec les séquences d’ADN de génomes provenant d’autres bases de données publiques. [14].
Ils ont obtenu 4,5 x 105 séquences (7,5 x 107 nucléotides). De ce nombre, 97 pour cent « étaient d’origine génomique et 3 pour cent étaient d’origine étrangère, dont 0,16 pour cent de génomes bactériens, 0,02 pour cent issus de virus et 0,01 pour cent issus de champignons. Dans l’ensemble, le profil de l’ADN circulant ressemblait à l’ADN génomique avec les exceptions suivantes.

Les séquences du chromosome 19 sont sous-représentées ; le chromosome 19 contient la plupart des gènes et il a la plus grande quantité d’éléments Alu, une sous-classe des éléments nucléaires courts entrecoupés, spécifiques des primates (SINE), qui se propagent partout dans le génome par rétro-transposition.

Les séquences Alu sont cependant sur-représentées, avec 11,4 + 0,4 pour cent d’échantillons d’ADN circulant, par rapport à 8,5 + 0,8 pour cent dans les échantillons génomiques ; par ailleurs, les éléments nucléaires longs entrecoupés L1 et L2 (LINES) étaient sous-représentés, ce qui représente 19 pour cent dans les échantillons d’ADN sérique, comparativement à 22,8 pour cent dans les échantillons génomiques.

Il faut souligner qu’il y avait les plus grandes variations individuelles relatives de l’ADN circulant pour les séquences codantes, qui variaient de 0,78 à 1,4 fois par rapport aux séquences génomiques ; des séquences régulatrices non traduites, allant de 0,58 à 1,3 fois par rapport aux séquences génomiques, et des pseudogènes (des gènes reliques que l’on croyait n’être plus actifs) variaient de 0.85 à 1.15 fois par rapport aux séquences génomiques. Les chercheurs concluent que la fourniture non-specifique (due à la mort cellulaire) n’est pas la seule origine de l’ADN circulant.

Néanmoins, le rôle de l’ADN sécrété activement à partir de cellules vivantes est inconnu. Il a été suggéré que l’ADN circulant participe à la recombinaison homologue avec l’ADN génomique, et que ce processus peut corriger les mutations ainsi qu’induire des modifications génétiques, avec l’ADN des fragments externes servant en tant que molécules de référence [15]. Récemment, une importante littérature a mis en lumière la puissance transformatrice des transfusions sanguines qui est le plus probablement due à des acides nucléiques circulants [16] (voir Darwin’s Theory of Pangenesis, the Hidden History of Genetics, & the Dangers of GMOs, SiS 42).

Les espèces d’ARN circulants, en matière de santé, font partie du vaste réseau de l’ARN de régulation, découvert en quelques années depuis que les travaux sur le génome humain ont été annoncés [3]. Quelques 97-98 pour cent de la transcription ne codent pas pour des protéines, et le travail de médiation entre l’ADN et les protéines est au centre du domaine de la vie moléculaire.

En raison de mécanismes répandus, tels que l’épissage alternatif, le trans-épissage et l’édition de l’ARN [4], de nombreuses espèces d’ARN ne peuvent pas être facilement mises en correspondance avec le génome. Le tableau devient encore plus complexe dans le cas d’états pathologiques. Toutefois, cela peut offrir des posibilités et des opportunités pour faire des diagnostics.

Certaines des plus impressionnantes applications des acides nucléiques circulants, en matière de diagnostic, ont été basées sur les ARN, et initiées à partir de mises au point effectuées par Howard Urnovitz (voir ci-dessus). Nous avions d’abord présenté son travail en 2003 [17] (Dynamic Genomics, SiS 19), quand il avait signalé la présence d’un unique marqueur à ARN chez les patients touchés par le Syndrome de la guerre du Golfe et par d’autres maladies chroniques.

Deux ans plus tard, Howard Urnovitz avait développé le premier test pour détecter la maladie de la vache folle Living Test for Mad Cow Disease [18] (SiS 28), test encore une fois basé sur de simples marqueurs génétiques qui avaient été retrouvés chez 100 pour cent des bovins atteints d’ESB, ainsi que chez 100 pour cent des animaux asymptomatiques à haut risque (porteurs sains sans symptômes), et ceci avait été diagnostiqué six mois avant que la maladie ne se déclare. .

Ce travail de diagnostic a été poursuivi et il a été confirmé récemment à l’aide du séquençage d’ADN à haut débit [19]. Des motifs pathogènes spécifiques ont été trouvés dans l’ADN circulant chez les wapitis et le bétail au cours d’une expérience de 25 mois, dans laquelle les animaux ont été infectés par voie orale avec du matériel pathogène du dépérissement chronique.

Des séquences spécifiques d’infection ont été trouvées assez tôt, au bout de 11 mois : chez les wapitis, au moins trois mois avant l’apparition des premiers signes cliniques, et au moins quatre mois avant l’apparition des signes cliniques chez les bovins. Quelques-uns des motifs génétiques identifiés contiennent un facteur de transcription qui relie les sites d’intégration rétrovirale endogène, ce qui suggère que des rétrovirus peuvent être reliés à la maladie de la vache folle. Dès lors, le diagnostic prédictif est maintenant disponible [20]. Pendant ce temps, les recherches sur la science fascinante du génome dynamique [‘génome fluide’] se languissent.

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Définitions et compléments en français :

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Jacques Hallard, Ing. CNAM, consultant indépendant.
Relecture et corrections : Christiane Hallard-Lauffenburger, professeur des écoles
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